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　　林业科学现代农业科技2012 年第 22 期Trizol 法、硫氰酸胍/酚法、酚/SDS 法、盐酸胍法、硫氰酸胍法都是提取 RNA 的 常用 方法， 其中 Trizol 法最为 常用 。Trizol 使样品匀浆化， 细胞裂解， 释放细胞内 含物， 同时因含有 RNase 抑制 剂 可防止 RNA 降解， 在一定程度上 保证了RNA 的完整性。加入氯仿， 样品发生分层。RNA 存在于上层水相， 可用 异丙醇沉淀回收；DNA 存在于中间层， 可用 乙醇沉淀回 收； 蛋白 质存在于下层有机相， 可用 异丙醇沉淀回收。因此， 该方法可以同时分离一个样品中的 RNA、DNA 和蛋白 质。Trizol 法在提取动物组织 RNA 时颇为有效， 但在多糖多...

　　林业科学现代农业科技2012 年第 22 期Trizol 法、硫氰酸胍/酚法、酚/SDS 法、盐酸胍法、硫氰酸胍法都是提取 RNA 的 常用 方法， 其中 Trizol 法最为 常用 。Trizol 使样品匀浆化， 细胞裂解， 释放细胞内 含物， 同时因含有 RNase 抑制 剂 可防止 RNA 降解， 在一定程度上 保证了RNA 的完整性。加入氯仿， 样品发生分层。RNA 存在于上层水相， 可用 异丙醇沉淀回收；DNA 存在于中间层， 可用 乙醇沉淀回 收； 蛋白 质存在于下层有机相， 可用 异丙醇沉淀回收。因此， 该方法可以同时分离一个样品中的 RNA、DNA 和蛋白 质。Trizol 法在提取动物组织 RNA 时颇为有效， 但在多糖多酚含量较多的植物样品中， 因其无法抑制多糖多酚对DNA 和 RNA 分相的干扰， 即可能造成 DNA 或者多糖多酚次级代谢产物的大量残余， 影响抽提的 总 RNA 的纯度。直接裂解过柱子的方法是目 前最先进的方法， 包括 Qiagen 的RNeasy plant mini kit 盒子。 该试验对 QIAGEN RNeasy PlantMini 试剂盒法（胍盐法）进行了研究， 拟比较其与 Trizol 法的优劣， 以探索更好的 RNA 提取方法。1材料与方法1.1试验材料植 物 材 料 ： 狗 尾 草 新 鲜 叶 片 。 试 剂 与 仪 器 ： QIAGENRNeasy Plant Mini 试剂盒、液氮、研钵、离心机、电泳仪。1.2试验方法称取新鲜狗尾草叶片组织不超过 100 mg， 在预冷的研钵中研磨成细粉， 转移到 2 mL EP 管中。①待液氮挥发完毕 ，在 样 品 未 解 冻 状 态 下 加 入 450 mL 提 取 缓 冲 液 RLT， 立即剧烈震荡， 充分涡旋。注意 RLT 应加入 1/100 体积的 14.5M -巯基乙醇， 该过程也可在 56 ℃温育 1~3 min；②将裂解液全部转移到淡紫色柱子中， 全速离心 2 min， 小心吸取上清至新管中。注意该步中裂解液被均质化， 细胞碎片、蛋白质等大分子物质吸附在柱膜上， 小分子在上清中， 故应小心吸取上清， 勿吸到沉淀；③在新管中加入 1/2 样液体积的无水乙 醇， 立即 吹打混合。 将混合后的 约 650 L 样液， 包括形成的所有沉淀转移到粉红色管中， 轻柔的盖上离心管盖子，10 000 r/min， 离心 15 s， 弃掉下清液；④向粉红色管中加入 350 L RW1 缓冲液，10 000 r/min， 离心 15 s， 冲洗离心柱， 弃下清；⑤向粉红色管中加入 700 L RW1 缓冲液，10 000 r/min， 离心 15 s， 冲洗离心柱， 弃下清；⑥将离心柱转移到一新的 2 mL 收集管上， 加入 500 L RPE 液，10 000r/min 离心 15 s。弃去管内液体，重复使用收集管。注意：试剂盒提供浓缩的 RPE 洗脱液， 使用前必须加入 4 倍体积的 96%~100%乙醇；⑦向柱中加入 500 LRPE 液， 10 000 r/min 离心 2 min， 冲洗滤膜， 干燥离心柱， 弃掉下清液。注意该步需保证无乙醇残留， 否则影响后面的试验； ⑧将 吸 附 柱 放 入新的 1.5 mL 回 收管中 ， 加入 30～50 L 的 RNase-free water到柱中， 10 000 r/min 离心 1 min， 释放 RNA。 注意若 RNA产量在 20 g 以上， 用 30~50 L 无 RNase水 再洗脱 1 次。RNA 样品 存于-20 ℃或-80 ℃冰箱； ⑨用 高精度无需比色皿分光光度计测定 RNA 的含量； 琼脂糖凝胶电泳检测[1-3]。2结果与分析采用高精度无需比色皿分光光度计测定 RNA 的含量，QIAGEN RNeasy Plant Mini 试剂盒提取的狗尾草 RNA 含量为 6 080 ng/L，Trizol 法 提 取的 狗 尾 草 RNA 含量 为 1 004ng/L。由图 1 可以看出 ，1、2 泳道的条带比后面泳道的条带要亮， 且少有降解。由 此表明， 用 QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取简单植物组织 RNA 确实比较有效。3结论与讨论通过对比 2 种方法提取出 的 RNA 产量和纯度， 发现用QIAGEN RNeasy Plant Mini 试剂盒提取简单植物组织 RNA确实比 Trizol 法有效。该方法是通过裂解液裂解细胞， 该裂解液含有 RNase 抑制剂， 不含有氯仿、苯酚等有毒物质。通过离心分离细胞碎片， 过淡紫色柱子过滤出 多糖及蛋白 质，（下转第 178 页）狗尾草总 RNA 提取方法研究王 凯（山东师范大学生命科学学院， 山东济南 250014）龚秀秀董 雯丁建峰摘要RNA 是由 核糖核苷酸经磷酯键缩合而成的长链状分子。RNA 与 DNA、蛋白 质、多糖等物质普遍存在于细胞中。常用 的总 RNA提取的方法是 Trizol 法， 该方法可同时分离一个样品的 RNA、DNA 和蛋白 质， 但由于植物材料中多糖多酚的存在及操作环境的影响，RNA产量偏低。QIAGEN RNeasy Plant Mini 试剂盒法（胍盐法）是通过裂解液（不含苯酚、氯仿）裂解细胞， 使 RNA 和 DNA 同时通过柱子， 再将其分离的总 RNA 提取法。该方法既克服了 Trizol 在多糖多酚存在的情况下不能成功分离 RNA 与 DNA 的弊端， 又保证在提取过程中不使用苯酚氯仿等有毒试剂， 并且能在一定程度上提高 RNA 的产量和纯度。关键词狗尾草；RNA； 提取方法；Trizol 法； 胍盐法中图分类号S713文献标识码A文章编号 1007-5739（2012）22-0156-01收稿日 期2012-09-11156